0 引言 Introduction

静电纺丝制备的组织工程支架微观上具备纳微米级别的纤维结构，呈交错的网络形状，具有可控的力学性能和粗糙度，高孔隙率和孔径的纤维排列可模拟细胞外基质结构，进而促进细胞的黏附、生长和分化[1]。聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯(poly3-hydroxybutyrate4-hydroxybutyrate，P34HB)的可纺性良好，具备一定的力学性能，其电纺纤维支架材料应用于骨组织工程可修复SD 大鼠颅骨缺损[2]，但亲水性较差限制了其在生物医学方面的应用[3-4]。现阶段对材料的改性分别有物理改性[5-7]、化学改性[8-10]、生物活性物质修饰[11-13]、纳米粒子修饰等方法[14]，但过程较为复杂且不可控因素增加。作者设想，能否将一两种材料通过共同溶剂简单混合后，基于静电纺丝技术制备一种既可以保证良好生物相容性的同时又能够使原材料发挥各自优势特点的支架材料。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是亲水性生物材料，具备良好的生物相容性，在生物制药领域应用广泛，与P34HB 的复合支架材料在促进骨再生上取得了有效作用[15]。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)含有羟基(-OH)、羧基(-COOH)和羰基(-CO-)，能提供更大的表面积且表面活性更强，同时其边缘的羟基(-OH)、羧基(-COOH)可通过静电力与其他材料相结合，并且其特殊的sp2键合和六角形碳结构具有较佳的机械强度，能够有效调控细胞行为[16-17]，为细胞提供定位点和诱导骨髓间充质干细胞成骨分化[18-19]，可作为涂层材料改善钛合金内固定与骨组织之间的相容性[20]。另外，石墨烯基材料具有良好的抗菌性能[21]，能够保持一定的抗菌作用，避免细胞生长的污染风险，但GO本身不具备可纺性，需要和其他材料复合才能静电纺丝成为纳微米纤维而发挥作用。此外，GO 与PEG 4000 相结合可降低GO 的不良作用[22]。

实验基于静电纺丝技术将P34HB、PEG、GO 相互整合，进行体外生物相容性和力学研究，验证此配比方案是否引起物理结构和化学属性改变，是否可保留良好的生物相容性及稳定的力学属性，成为新的支架材料以改善支架功能。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 基于高压静电纺织技术的组织工程支架构建实验。

1.2 时间及地点 实验于2018 年5 月至2019 年1 月在贵州医科大学组织工程与干细胞实验室完成。

1.3 材料 P34HB(清华大学高分子研究所，中国)；PEG 4000(北京索莱宝科技有限公司)；GO 粉(广州贝奥吉因生物科技有限公司)。

1.3.1 实验动物 4 周龄SD 大鼠，体质量50-60 g，雌雄不拘，由贵州医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(黔)2012-0001。动物实验获贵州医科大学实验动物伦理委员会批准，批准号：。

1.3.2 实验主要试剂及仪器 无水乙醇(天津永大化学试剂有限公司)；二氯甲烷(天津富宇化学试剂公司)；DMEM 培养基(GBICO，Co.)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；激光共聚焦显微镜LSM5 Excitor(Carl Zeiss)；接触角测试仪(DropMaster，DMo-501)；扫描电镜(Hitachi，日本)；多功能酶标仪(SpectraMax M5，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)；力学测试仪(上海倾计仪器有限公司)；超声分散仪(Scientz-2400F，宁波)；静电纺织机(SS-2534H，Ucalery，中国北京)；MTT(北京索莱宝科技有限公司)；Alamar Blue 测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；其他分析级化学试剂和溶剂均来自细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室(贵州医科大学，贵阳，中国)。

1.4 实验方法

1.4.1 静电纺丝前驱液及支架制备

静电纺丝前驱液的制备：GO 质量浓度在1.0 g/L 时生物相容性较好[19-20]，因此将10 mg GO 粉末置于10 mL 二氯甲烷中进行避光超声分散3 h。称量0.7 g P34HB、0.5 g PEG 粉末同时混入上述溶液中磁力均匀溶解2 h，最后定容10 mL(P34HB/PEG/GO 组)。取0.7 g P34HB 溶 于10 mL 二 氯甲烷中避光超声分散3 h(P34HB 组)。取0.7 g P34HB 及0.5 g PEG 共同溶于10 mL 二氯甲烷中避光超声分散3 h(P34HB/PEG组)。

静电纺丝支架的制备：取10 mL 注射器6 号注射针头，置于电纺机中，使用锡箔纸滚轴为接收器，接收器转速为20 r/min，设置正电压约10 kV，负电压10 kV，温度37 ℃，相对湿度20%-40%，静电纺丝前驱液推注速度0.3 mm/min，接收距离15-20 cm(从喷头到接收器)，收集取下后放置于真空烘箱中干燥48 h，使残余有机溶剂蒸发，将制备的纤维支架裁剪为实验所需大小后备用，双面分别紫外照射4 h 除菌。

1.4.2 支架表面形态学检测 利用体视显微镜和扫描电子显微镜(加速电压为20 kV)对支架进行表面形态、纤维取向、纤维直径表征。使用Image-Pro Plus 6.0 对每一组样品随机选取100 根纤维的平均直径进行评估。

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