0 引言 Introduction

组织工程骨符合生理状态修复且避免了传统骨移植供骨区并发症，成为目前生物医学研究领域的前沿之一[1]。将组织工程骨移植入体内后，其早期营养只能依靠周围组织渗出液及少量血浆，因此这种方式的营养范围有限[2-3]，移植物中央的供血和供氧受到限制，从而导致中央细胞增殖、分化、分泌等生理功能受到影响甚至死亡，致使组织工程骨移植物修复骨缺损失败[4-5]。因此，组织工程骨的早期血管化是决定组织工程骨移植成功与否的关键之一。目前促进组织工程骨早期血管化的方法主要有预置血管技术、细胞技术、生长因子。相较于预置血管技术的操作技术要求高、血管过度生长及生长因子的存活与缓释问题，细胞技术有其明显优势[6]。WANG 等[7-9]研究表明，人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)植入动物体内后能形成微管道结构并与植入物血管相通，且当HUVECs 与骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)共培养时HUVECs可表达骨形态发生蛋白2 因子，该因子能诱导BMSCs 向成骨方向分化[10]。

羟基磷灰石是人体骨骼中主要的无机成分，其力学强度与正常骨组织相近，但其有机械性能差、脆性较大、易折断、难降解等缺点。磷酸钙类生物陶瓷与天然无机骨质成分相似，具有良好的骨传导和骨诱导性及生物相容性，无毒，可被降解吸收[11]，但其有降解速度过快、可塑性较差、机械性能不稳定等缺点。常选用羟基磷灰石与磷酸三钙(hydroxyapatite tertiary calcium phosphate，HA-TCP)复合应用，取长补短，以提高支架性能[12]。

因此，实验选用BMSCs/HUVECs 与HA-TCP 支架共培养，再将共培养支架植入大鼠颅骨缺损模型，观察BMSCs/HUVECs 与HA-TCP 支架共培养复合物在体内的早期促血管生成能力，为组织工程骨早期血管化提供实验支持。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体内、外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年3 至9 月在西南医科大学口腔医学院口颌面修复重建与再生实验室完成。

1.3 材料 3D 打印HA-TCP 支架由四川大学生物材料工程研究中心提供，规格见表1。

表1 ｜实验应用的生物支架材料介绍Table 1 ｜Introduction of biological scaffold materials used in experiments项目 羟基磷灰石-磷酸三钙支架材料来源 四川大学生物材料工程研究中心材料制备方法 3D 打印材料组成成分 羟基磷灰石、磷酸三钙材料组分比例 羟基磷灰石∶磷酸三钙=3 ∶7材料孔隙率 70%-80%材料大孔径 100-400 μm材料形状 圆柱形材料规格 直径9 mm，厚度2 mm

1.3.1 实验动物 60 只6-8 周龄雌性SD 大鼠，体质量250-300 g；10 只4 周 龄 雄 性SD 大 鼠，体 质 量120-160 g，由西南医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK(川)2018-065。实验已经西南医科大学动物伦理委员会批准，动物伦理审查号：。

1.3.2 实验试剂和仪器 细胞外基质培养基、HUVECs(美国，Sciencell 公司)；DMEM 培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(HyClone 公司)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、非冻型组织RNA 保存液、多聚甲醛、电镜固定液、RIPA 裂解液、BCA、大鼠(CD31/CD34)Elisa 检测试剂盒( 中国，Solarbio公司)；大鼠CD31/CD34 抗体(一抗)、羊抗兔IgG(二抗)(北京博奥森生物技术有限公司)；血管内皮生长因子抗原ELISA 检测试剂盒(晶美生物工程有限公司)；戊巴比妥钠(上海化学试剂公司)；DAB 染色试剂 (武汉博士德生物工程有限公司)；二甲基亚砜 (美国，Amresco 公司)；蛋白上样缓 冲 液( 中 国，beyotime)；PVDF 膜( 美 国，millipore)；TBST、Western 封闭液(中国，bioder)；倒置相差显微镜、光学显微照相系统(日本，Olympus 公司)；电动打磨机(韩国，STRONG 公司)；扫描电子显微镜(日本，HITACHI 公司)；Micro PET/CT( 德国，SIEMENS 公司)；MILLI-QB 型超纯水系统(美国，Millipore 公司)；酶标仪(上海精宏试验设备有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 BMSCs 的分离、培养和鉴定 处死4 周龄SD 大鼠后取四肢股骨，用DMEM 培养基反复冲洗骨髓腔，过滤组织块得到细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，加入3 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养液吹打混匀，以细胞浓度为(6-8)×109L-1接种于培养皿，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，当细胞达到约80%融合量时消化传代，显微镜下观察细胞形态，并行成骨诱导和茜素红染色鉴定细胞为BMSCs，当传至第3 代时，消化制备细胞浓度为3×108L-1的细胞悬液备用。BMSCs 的鉴定已由前期体外实验完成[13]。

1.4.2 复苏HUVECs 将冻存HUVECs 置于37 ℃恒温水浴箱中复温，取细胞悬液1 000 r/min 离心5 min 后弃上清液，加入细胞外基质培养液重悬，以细胞浓度为1×107L-1接种于新的培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，待细胞传至第3 代时，消化制备细胞浓度为3×108L-1的细胞悬液备用。

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