0 引言 Introduction

细胞外基质是组织内细胞的复杂动态结构支持，由蛋白质、糖蛋白和多糖组成。人体中的每种组织都具有独特且蛋白质含量多样的细胞外基质，不仅为细胞黏附和组织提供适当的结构支架，而且还调节许多不同的细胞功能，以维持体内平衡[1]。细胞外基质包含生物活性序列，这些序列通常被在多种细胞类型上表达的特定细胞表面受体所识别，从而促进了广泛的细胞活性[2]。细胞外基质重塑可以暴露先前隐藏的生物活性序列，或降解完整的生物活性序列[3]。此外，消化后的可溶性细胞外基质片段通常以不同于不溶性支架的方式调节细胞行为。

考虑到细胞外基质在组织结构支持中的作用，在开发基于细胞外基质的组织工程支架方面已进行了大量研究[4-8]，在这些研究中，支架通常被用来促进细胞黏附和浸润，继而促进细胞分化为功能性的组织。但所有再生过程都有一个共同的步骤：炎症[4，9]，由于它是愈合过程的第一步，因此炎症反应会触发一系列连续的事件，从而导致组织体内稳态的恢复。但当这种炎症失调时会导致纤维化，从而导致组织功能丧失，并最终导致器官衰竭[10]。因此，再生策略必须考虑炎症的重要性，并最终针对炎症以改善最终的再生结果。

最初，对植入的炎症反应主要是先天性免疫细胞(包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞)的激活，随后是树突状细胞的浸润，然后这些髓样效应子通过巨噬细胞和树突状细胞将抗原呈递给次级淋巴器官中的T 和B 细胞，从而桥接到适应性免疫系统，介导植入材料的长期免疫识别[4]。损伤和植入材料的初始炎症反应阶段以动态巨噬细胞反应为标志，巨噬细胞是极具可塑性的细胞，具有根据环境和生物活性信号分子改变其表型(极化)的能力。实际上，这些细胞可以从炎性(M1型)极化为抗炎(M2 型)表型，M1 型巨噬细胞在小鼠中以肿瘤坏死因子α 或其他炎性细胞因子的分泌、诱导型一氧化氮合酶和CD86 的表达为特征。紧随其后的是促进愈合阶段，其特征在于M2 型巨噬细胞分泌白细胞介素10 及精氨酸酶和CD206 的表达[11-12]；转化生长因子β、血管内皮生长因子及其他细胞因子也可被分泌，巨噬细胞表型的几种亚型在伤口愈合过程已经被表征[13]。因此，组织工程学中的一种新兴策略是设计可以直接控制宿主免疫反应的材料[2]。已有研究证明，细胞外基质生物支架不仅会引起良好的宿主先天免疫应答，特别是巨噬细胞应答，而且这种应答是重建性细胞外基质介导组织重塑所必需的[14]，组织工程领域已经开始探索不同方法来改善受损组织中M2 巨噬细胞的存在，但在软骨组织工程领域鲜有相关研究结果报道。解放军总医院骨科研究所开发的第4 代软骨组织工程技术，基于同种异体脱细胞软 骨 基 质(decellularized cartilage extracellular matrix，DCM)多孔支架，并成功应用于临床[15]。课题组基于软骨脱细胞技术成功制备猪来源 DCM，经过冻干交联制备出取向性多孔软骨组织工程支架，并进行了大量基础及临床前研究，证明了其作为软骨组织工程支架的良好应用前景[16-17]。实验制备了DCM 并对其进行胃蛋白酶促溶解处理，经过组织学及定量表征，同时探究其胃蛋白酶消化前后对小鼠巨噬细胞系表型极化的调控作用，初步证明了DCM 的免疫调节作用，为改进软骨组织工程材料提供了新的思路。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2018 年12 月至2019 年7 月在解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料 新鲜猪关节软骨购买于北京屠宰场。

1.3.1 实验用主要细胞及试剂 小鼠巨噬细胞系RAW264.7(ATCC TIB-71，上海奥陆生物)；甲苯胺蓝、蕃红O染色及天狼星红染色试剂(北京索莱宝科技有限公司)；糖胺多糖定量试剂盒(中国，杰美基因)；羟脯氨酸定量试剂盒(南京建成)；DMEM 高糖细胞培养基(美国Corning 公司)；脂多糖、猪来源胃蛋白酶、胎牛血清白蛋白BSA(美国Sigma公司)；胎牛血清(元亨金马生物科技有限公司)；小鼠干扰素γ、白细胞介素4(美国Peprotech 公司)；小鼠CD86 抗体、小鼠CD206 抗体(美国Abcam 公司)；DAPI 试剂，荧光二抗(中杉金桥公司)；PE-CD86、APC-CD206 流式抗体(美国Biolegend 公司)。

1.3.2 实验用主要仪器 CO2培养箱Hereus BB5060 型(德国Hereus 公司)；OlympusIX70 型倒置显微镜、BH-2 型Olympus生物显微镜、IX70 型荧光显微镜(日本东京Olympus 公司)；超净工作台月坛双人水平层流型(北京半导体元件一厂)；冷冻干燥机(北京博医康技术有限公司)；Beckman Allegra X-22R 离心机；Celesta 型流式细胞仪(美国BD 公司)。

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