0 引言 Introduction

目前多种疾病如唇腭裂、炎症、创伤、颌骨囊肿、肿瘤等均会造成骨的缺损，治疗不当会严重影响外观和功能，骨移植材料是目前研究的要点和难点[1]。羟基磷灰石具有良好的生物相容性与降解性，但人工合成的羟基磷灰石质脆、机械性能差且亲水性能有限，细胞黏附能力和生物活性受限，缺乏骨诱导性能[2]，临床运用时常将其与自身骨混合使用，但还是存在容易吸收或感染等问题。诸多学者通过将其纳米化[3]、或与有机物、无机物等结合起到取长补短的作用[4-6]，是骨组织工程中的研究热点。聚多巴胺是一种天然黑色素，具有良好的生物相容性，不会引起免疫排斥反应[8-10]，而且其化学结构类似海洋贻贝分泌的黏蛋白，其中的邻苯二酚基团具有超强的黏附性能，可在多种材料表面甚至超疏水材料表面进行超强黏附，已被应用于改善金属、陶瓷、半导体、纤维等多种有机材料和无机材料的表面性能[11-13]。目前聚多巴胺涂层的应用多见于纤维和化学合成材料，如甘氨酸乙酯、丙氨酸乙酯、聚乳酸等[14-16]。相关学者研究的干细胞主要集中于间充质干细胞、脂肪干细胞[11-13]。相比以往的研究，此次实验采用人根尖乳头干细胞，取材更加容易，可以从患者第三磨牙中提取，变废为宝，更具有临床应用价值；采用临床常用的骨修复材料——羟基磷灰石生物陶瓷，更加接近于临床运用，在羟基磷灰石生物陶瓷表面进行聚多巴胺涂层，探讨涂层前后羟基磷灰石生物陶瓷的理化性能及细胞毒性变化，以期为聚多巴胺-羟基磷灰石支架在组织工程中的应用及后期聚多巴胺涂层作为中介黏附、缓释其他因子的体内外研究提供实验依据。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年1 月至2020 年4 月在西南医科大学中心实验室、遂宁市中心医院内科九楼基础实验室完成。

1.3 材料 羟基磷灰石生物陶瓷(四川大学生物材料工程研究 中 心)；Tris-HCl(pH=8.5，Beyotime)；DEPC 水(VICMED)；细胞爬片(靓宜)；DAPI 溶液、盐酸多巴胺、罗丹明标记鬼笔环肽(Solarbio)；Ⅰ型胶原酶、胰酶消化液(Gibco)；Dispase Ⅱ(SIGMA)；进口胎牛血清(Sciencell)；液体培养基α-MEM(HyClone)；CCK-8 试剂盒(东仁化学科技)；超声波清洗器(宁波新芝)；临界点干燥仪K850(英国Quorum)；离子溅射装置E-1045 (日本)；扫描电子显微镜 Inspect(美国FEI公司)；光学接触角测量仪SDC-100(东菀市晟鼎精密仪器有限公司)；多功能酶标仪(德国 BMG Labtech)；激光共聚焦显微镜(德国 Leica)。

1.4 实验方法

1.4.1 聚多巴胺-羟基磷灰石生物陶瓷的制备 按2 g/L 质量浓度配置多巴胺-Tris 缓冲液，将羟基磷灰石生物陶瓷(直径10 mm，厚1 mm)高温高压灭菌后置于多巴胺-Tris 缓冲液中，缓冲液刚好淹没样品。在25 ℃、无光、常氧条件中震荡摇匀，反应24 h 后去离子水超声洗涤3 次，总共10 min，吹干备用。

1.4.2 陶瓷平均孔径和孔隙率检测 将聚多巴胺涂层前后的羟基磷灰石生物陶瓷分别粘在导电胶上，临界点干燥，真空喷镀，扫描电镜下随机选择5 个位置，分别在300，1 000，2 000 倍下扫描拍照，观测聚多巴胺涂层前后陶瓷的形态，将放大300 倍的扫描电镜图像进行二值化处理，近似得到面孔隙率，根据公式计算平均孔径：平均孔径=面积×面孔隙率/面孔数，取平均值。

1.4.3 陶瓷水滴接触角检测 将聚多巴胺涂层前后的羟基磷灰石支架分别静置于光学接触角测量仪SDC-100 上，滴4 μL蒸馏水，测量接触角，分析涂层前后陶瓷的亲水性变化。

1.4.4 人根尖乳头干细胞的分离培养 废弃的第三磨牙来自14-18 岁健康的青少年，牙根还未彻底形成，无牙体牙髓、牙周损坏，供者及其家属签署了实验知情同意书。采用改良组织块法培养根尖乳头干细胞，方法为：将牙乳头剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小，采用3 g/L Ⅰ型胶原酶和4 g/L Dispase 酶按1 ∶1 消化处理半小时，70 μm 滤网过滤，离心、培养、换液，待细胞长到80%-90%时传代。取第3 代根尖乳头干细胞进行流式细胞表面抗原检测鉴定，检测STRO-1、CD90、CD146、CD34、CD45 的表达，该检测已在前期研究中进行并证实了分离的细胞为干细胞[17]。

1.4.5 聚多巴胺涂层对细胞黏附力的影响 第3 代人根尖乳头干细胞以1×105/mm3的密度接种于未涂层陶瓷与聚多巴胺涂层的细胞爬片上，15 min 后，倒置显微镜下察看细胞爬片及周围人根尖乳头干细胞的黏附、聚集情况；鬼笔环肽红染细胞骨架，激光共聚焦显微镜下观察细胞形态及其伸展情况；DAPI 蓝染细胞核，200 倍下随机记录每组各5 个镜下数目，取平均值。

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